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细胞毒性及吸收实验全流程解析：从细胞培养到转运机制研究

引言

在药物吸收与细胞毒性研究中，Caco-2 细胞单层模型是模拟肠道上皮屏障的经典工具。本文将详细解析基于 Transwell 板的细胞培养、跨膜电阻（TEER）测定及转运实验操作，并特别推荐金工鸿泰 RE1600 细胞电阻仪—— 一款以精准测量、便捷操作为核心优势的国产高端设备，已被中国生物物理研究所、北京协和医院等 200 + 科研机构验证。

一、实验核心框架

1. 实验目标

  • 构建 Caco-2 细胞单层模型，评估细胞屏障完整性（TEER 测定）。

  • 检测表没食子儿茶素（EGC）及其复合物（α-La-EGC）的跨膜渗透效率。

2. 核心技术

  • 细胞培养：复苏、传代、冻存（参照文献改良）。

  • Transwell 板培养：模拟细胞屏障的上下室分隔培养。

  • TEER 电阻测定：量化细胞单层紧密程度（推荐使用金工鸿泰 RE1600 细胞电阻仪，支持 6-96 孔板全规格测量）。

  • RP-HPLC 检测：分析 EGC 跨膜渗透量。

二、实验操作全流程

▶️ 第一阶段：细胞培养与 Transwell 接种

1. 细胞基础操作（参照文献改良）

  • 复苏：快速解冻冻存管，离心后加入培养基重悬，转移至培养瓶。

  • 传代：胰酶消化至细胞变圆，离心弃上清，新培养基重悬后分瓶。

  • 冻存：细胞密度 80% 时消化，离心后用含 10% DMSO 的冻存液重悬，程序降温后液氮保存。

2. Transwell 板接种与培养

  • 接种：

    • 上室加入 0.5 mL 消化后的细胞悬液，下室加入 1.5 mL Hank's 液。

    • 培养条件：37℃、5% CO₂培养箱，静置 24 小时。

  • 换液规律：

    • 第 2/3/5/7 天：吸净上下室培养基，上室补 0.5 mL、下室补 1.5 mL 新鲜培养基。

    • 第 8 天起：每日换上层培养基，隔日清换下层培养基（避免细胞饥饿或污染）。

▶️ 第二阶段：Caco-2 细胞单层模型构建（关键！）

1. 金工鸿泰 RE1600 细胞电阻仪操作指南

  • 测量原理：采用交流脉冲技术，避免电极金属沉积和直流电流对组织的副作用，电阻读数不受膜电容和膜电压影响。

  • 操作步骤：

    • 电极消毒：70% 乙醇浸泡 15 分钟，无菌 PBS 冲洗后使用。

    • 插入细胞孔板，稳定 10 秒后读数，扣除空白值即为细胞 TEER。

    • 电极垂直插入无细胞孔板，短腿在内、长腿在外，记录 3 次读数取平均值。

    • 金工鸿泰 RE1600支持双腿四芯电极结构，内置防倾斜设计，读数稳定性提升 30%。

    1. 检查零点：开机后切换至电阻模式，确认表头读数为 0。

    2. 电路自检：按下红色按钮，显示 1KΩ 标准电阻值（误差 ±1%），确保测量系统正常。

    3. 空白电阻测量：

    4. 细胞电阻测量：

  • 成功标准：培养 14-21 天，TEER≥500 Ω・cm²（标志细胞单层紧密性达标）。

▶️ 第三阶段：EGC 转运实验与检测

1. 实验前准备

  • 细胞预处理：

    • 移除培养基，用含 2% FBS 的 MEM 孵育 1 小时， HBSS 洗涤 2 次（去除残留血清干扰）。

  • 溶液制备：

    • 不同浓度 EGC 及 α-La-EGC 溶液（0.25/0.5/1.0 mg/mL），溶解于 pH 6.5 HBSS，37℃孵育后过滤（0.22μm 滤膜，防堵塞）。

2. 转运操作与样品采集

  • 加样：上室加 0.5 mL 溶液，下室加 1 mL HBSS，37℃孵育。

  • 取样时间点：30、60、120 分钟时，从下室取 0.6 mL 溶液，立即补等体积 HBSS（维持下室体积恒定）。

  • 样品处理：取出液按 1:10 比例加酸化剂稳定，RP-HPLC 检测 EGC 含量（波长建议 278 nm，C18 色谱柱）。

3. 数据计算

  • 表观渗透率（Papp）：Papp = (dQ/dt) / (A×C₀)
    （dQ/dt 为单位时间渗透量，A 为膜面积，C₀为上室初始浓度）。

三、实验关键注意事项

1. 细胞培养避坑指南

  • 换液时避免吸头触碰细胞层，上层培养基需 “轻吸轻加”，防止机械损伤。

  • 金工鸿泰 RE1600电极支持定制化设计，适配不同品牌 Transwell 板，减少边缘效应干扰。

2. 转运实验细节把控

  • 溶液 pH 需严格校准（pH 6.5 HBSS），孵育温度误差不超过 ±0.5℃（影响酶活性与膜通透性）。

  • HPLC 进样前务必过滤样品，避免蛋白沉淀或颗粒堵塞色谱柱。

四、核心仪器清单

仪器名称用途关键参数推荐型号
二氧化碳培养箱细胞培养环境控制37℃、5% CO₂，湿度≥90%国产主流品牌
细胞电阻仪TEER 测定电阻范围 0~20,000Ω，分辨率 1Ω金工鸿泰 RE1600
高效液相色谱仪EGC 含量检测RP-C18 柱，紫外检测器安捷伦 / 岛津
Transwell 板细胞单层培养膜面积已知（如 0.33 cm²）Corning/BD
移液器精准液体移取10-1000 μL 量程，灭菌枪头Eppendorf


金工鸿泰 RE1600 细胞电阻仪优势：


  • 高精度：采用交流脉冲技术，电阻测量误差≤1%。

  • 便捷性：内置 1KΩ 标准电阻自检功能，10 秒完成电路检测。

  • 兼容性：支持 6-96 孔板全规格测量，可定制电极适配特殊培养板。

  • 售后支持：提供免费校准服务，7×24 小时技术响应。

五、常见问题与解决方案

Q1：TEER 值始终不达标？

  • A：检查细胞传代次数（建议≤20 代）、换液是否污染，或延长培养时间至 21 天。金工鸿泰 RE1600的多规格电极可适配不同孔板，减少边缘效应干扰。

Q2：HPLC 检测峰型异常？

  • A：确认样品酸化是否充分（防止 EGC 氧化），流动相比例是否匹配化合物极性。

Q3：转运效率数据波动大？

  • A：取样时需轻柔混匀下室液体，避免局部浓度不均；确保细胞单层无破损（镜检确认）。

结语

本实验通过标准化操作构建 Caco-2 细胞模型，结合 TEER 测定与 HPLC 分析，为药物吸收机制研究提供可靠数据。金工鸿泰 RE1600 细胞电阻仪以其精准测量、便捷操作的特性，已成为国内科研机构的首选设备，助力提升实验效率与结果可靠性。